注意！PBMC复苏后计数，不同计数仪结果差异巨大，千万别被数据“骗”了！
在做免疫学、细胞治疗或疫苗研发的朋友们，一定对PBMC（外周血单个核细胞）不陌生。它可是我们研究T细胞、B细胞、NK细胞的重要“原材料”。
然而，有一个非常常见却又容易被忽视的问题——PBMC复苏后的细胞计数，用不同计数仪，结果竟然完全不同！
误差到底有多大？我们直接用数据说话。
实验小剧场
我们做了3组对比实验：
➡ 样本来源：同一份冻存的PBMC，相同复苏操作，分别计数3个批次样本；
➡ 计数仪类型：自动细胞计数仪A、自动细胞计数仪B、血球计数板（人工）
结果如下（单位：10⁶ cells/mL）
▶ 不同计数仪之间的活细胞浓度差异可达 20% 以上，活率差异在5%左右，有些计数仪会高估，有些会低估，如果你用高估的结果去做实验铺板，后果可想而知。
为什么PBMC复苏后“测不准”？
-
细胞聚团
冻存复苏后，PBMC容易形成小团块。普通明场计数仪会把2-3个细胞粘在一起当成1个，导致计数偏低。
-
死细胞与碎片干扰
复苏过程难免有部分细胞死亡，产生细胞碎片。台盼蓝染色有时无法完美区分碎片和小活细胞。
-
不同亚群大小差异
PBMC中淋巴细胞、单核细胞大小不同。有些计数仪对非典型大小的细胞识别不准。
-
计数原理不同
⏩ 明场+台盼蓝：依赖染料排除法，容易受碎片和聚团影响，且受仪器参数影响很大。
⏩ 人工血球计数板：依赖操作者经验，主观性强，但是更接近于真实细胞数量。
使用建议
✅ 1.同一实验周期内固定使用同一种计数仪
比“绝对准确”更重要的是一致性。前后对照实验，不要随意换计数仪。
✅ 2. 复苏后务必“静置休息”再计数
PBMC复苏后，建议在完全培养基中37℃静置1~2小时，让细胞状态稳定。
✅ 3. 用荧光计数仪及参数校正
目前国际上公认最快速精准的PBMC计数方法是AO/PI双荧光染色法【1】。AO和PI都是细胞核染料，只有有核细胞会被染色，无核细胞，细胞碎片及其他杂质不发光；这样就排除了红细胞、血小板等干扰因素。同时活细胞会被AO染色为绿色荧光，死细胞会被PI染色为红色荧光，在精准计数的同时也获得了精准的细胞活率。
✅ 4.仪器校准
因PBMC细胞群体的复杂性，在使用细胞计数仪计数时，需要对细胞计数仪的参数进行定制化调整，以获得准确的计数结果；细胞计数时需要将细胞密度调整至仪器计数合适的密度范围，过高或过低都易导致细胞计数结果不准。
温馨小提示
➡ 不同计数仪之间的差异有可能是“仪器误差”，也可能是系统性偏差。作为科研或生产人员，我们要做的不是盲目相信屏幕上的数字，而是：
理解方法差异 → 固定操作标准 → 交叉验证精度
【1】Chan L L Y, Laverty D J, Smith T, et al. Accurate measurement of peripheral blood mononuclear cell concentration using image cytometry to eliminate RBC-induced counting error[J]. Journal of immunological methods, 2013, 388(1-2): 25-32.
.png)
.jpg)