外周血单个核细胞（PBMC）来源于骨髓中的造血干细胞( HSCs )，主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。这些细胞是先天免疫和适应性免疫系统的关键组成部分, 可以保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染和异物侵扰, 并且能够消灭肿瘤细胞。

随着生物医学的快速发展，PBMC被广泛应用于各种领域，包括药物研发、分析验证及细胞治疗行业的相关研究中。冻存的PBMC相比与新鲜的PBMC有诸多优势：（1）批次间一致性好：冻存PBMC可以满足客户使用同一批次开展多次实验，提高实验结果的准确性和重复性；（2）便于存储和运输：冻存PBMC可以长期保存，不受时间和地点限制，方便运输；（3）减少成本：冻存PBMC可以预先备库，减少样本反复采集和处理的成本；（4）储存时间长：冻存PBMC可以在低温下长期保存，同时保持细胞的完整性，不会破坏细胞功能，延长样本的货架期。

但是冻存的PBMC在后续的实验操作中受复苏、处理、计数、培养等实验操作的影响，可能会导致最终的实验结果与目标脱离，故小编整理了以下冻存PBMC使用小技巧分享给大家。

冻存PBMC的接收和暂存

在接收到冻存PBMC样本时，需要核对样本批次号、规格，检查包装是否有破损等及保存温度是否正确，确认无误后转入液氮中进行暂存。

PART 2

冻存的PBMC在进行复苏前，可先放于-80℃冰箱或干冰中缓释液氮，液氮缓释完毕后，将冻存管放置于37℃恒温水浴锅中快速晃动加快融化（注意冻存管帽不可接触液面，否则易造成污染），等观察到冻存管中剩余1个微球冰晶时尽快拿出，避免细胞解冻过程中出现反玻璃化形成冰晶损伤细胞，复苏时间控制在1~2min。

因冻存液中含有一定浓度的DMSO（常温下会严重损伤细胞），复苏PBMC后需尽快去除。需要将复苏后的PBMC悬液转移至15ml离心管，使用DPBS或相应的培养基稀释10倍（注意需要缓慢添加稀释液），离心（参考：400g，10min，室温）吸除上清后加入相应培养基重悬细胞。

PBMC作为原代混合细胞群，其细胞大小、形态不完全一致，也可能会有少量红细胞及细胞碎片残留影响计数。目前国际上公认最快速精准的PBMC计数方法是AO/PI双荧光染色法，可有效避免红细胞、细胞碎片对细胞计数的干扰；因PBMC细胞群体的复杂性，在使用细胞计数仪计数时，需要对细胞计数仪的参数进行定制化调整，以获得准确的计数结果；细胞计数时需要将细胞密度调整至仪器计数合适的密度范围，过高或过低都易导致细胞计数结果不准。

PBMC作为原代细胞，在没有外源激活扩增的培养条件下会逐渐凋亡，故不建议长时间维持培养，短期内培养可使用完全培养基（如RPMI 1640+10% FBS），细胞密度(1-2) E6 /ml，在37℃，5%CO2培养箱中培养。

因为细胞的冻融过程对细胞会造成一定程度的损伤，冻存的PBMC在复苏后，不建议再次冻存，否则可能造成活率偏低，数量损失及严重的细胞成团等问题，而造成后续实验失败风险加剧。

冻存后细胞受个体差异影响，部分donor可能会出现复苏后的细胞培养成团情况，建议复苏后培养时在培养基中加入DNaseI酶降解由于部分细胞凋亡释放的DNA；也可以调低细胞密度（<1E6 /ml）隔夜培养，以减少细胞聚团；对于已成团的细胞，可以使用微孔滤网过滤去除细胞聚团，剩余细胞继续可维持培养，后续培养基本不再会出现成团。

PART8

在进行PBMC细胞处理时，直接或者间接接触PBMC的环境、耗材、试剂等都需要进行紫外、75%酒精等杀菌处理；PBMC的细胞悬液转移时需要在杀菌后生物安全柜中进行，避免直接暴露。对于新手小白，若担心微生物污染，可在培养基中加入1% PS来减少细菌、真菌污染的概率。